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临床及预后相关性研究pdf香港挂牌之全篇
更新时间:2019-10-18   浏览次数:
 

 

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      第一军医大学 硕士学位论文 临床及预后相关性研究 姓名:姚连生 申请学位级别:硕士 专业:耳鼻喉科 指导教师:李湘平 2002.5.23 缩略词表 中文摘要 目的 l 了解PCNA、p27、p53、p16蛋白及基因mRNA在下咽癌组织中的表 达。 2分析以上蛋白和基因表达与下咽癌临床生物学行为及预后的相关性, 为下咽癌的早期诊断、治疗及估价患者预后提供线探讨免疫组化与原位杂交结果之间的相关性。 方法 1用免疫组织化学染色SABC法检测48例于1994年1月~2000年1 月期间在南方医院手术切除的下咽癌和15例下咽部正常粘膜石蜡包 埋组织标本PCNA、p27、p53、p16蛋白的表达,并结合临床与随访 资料进行分析。 2原位杂交检测下咽癌细胞PCNA、p27、p53、p16基因mRNA的表达, 并结合免疫组化结果进行分析。 0结果 /?…_≮ l 下咽癌组PCNA、p53表达显著高于正常组(PO.ore),而p27、p16、 蛋白表达在下咽癌组明显低于正常组(P0.05)。 2 PCNA、p27、p53、p16蛋白表达均与肿瘤原发部位无关(PO.05)。 3 p27、p16蛋白表达与肿瘤临床分期呈负相关fSpearman等级相关, P0.0t),而p53、PCNA表达与临床分期正相关(PO.05)。 4 p27蛋白表达下咽癌组织分化程度呈正相关(Spearman等级相关, P0.01)。而下咽癌低分化组PCNA增殖指数显著高于高分化组 @0.05),而p16、p53蛋白表达与肿瘤组织分化无关(P0.05)。 5 p27、p53蛋白表达与淋巴结转移相关(Po.05),有淋巴结转移组p27 蛋白表达下降,p53蛋白表达增高;而PCNA、p16蛋白表达与淋巴 结转移无关伊0.05)。 6下咽癌患者术后存活期超过3年组p27、p16蛋白表达显著高于3年 以下组,而PCNA、p53蛋白表达则显著低于3年以下组伊o.05)。 7下咽癌中p27蛋白与p53蛋白表达呈负相关(Spearman等级相关, 呈负相关(P0.05)。 mRNA表达显著高于癌组织,而PCNA 8下咽部正常粘膜组织p16、p53 mRNA在癌旁组织中的表达显著低于癌组织中表达(P0.05): 9 O.6),而p53蛋白与mRNA表达基本不符(kappa指数o)。 mRNA的表达显著低于II期与I期下咽癌 IO临床Ⅳ期下咽癌p16 mRNA表达显著高于3年以下组 (Po.05),存活期超过3年组p16 结论 l mRNA表达可能与下咽癌的发生、 PCNA、p27、p53、p16蛋白及p16 发展有关,并可能作为下咽癌预后的参考指标。 2 下咽癌中PCNA、p27、p16蛋白表达分别与其基因mRNA表达基本 一致。 3下咽癌中p27基因水平上很少发生改变,其改变可能主要出现在转录 后;而p16基因改变可能主要表现为纯合性缺失或杂合性缺失,无义 突变及移码突变少见。 mRNA表达可能对下咽癌的研究意义不大。 4原位杂交检测PCNA、p27 5 PCNA可能作为下咽癌早期诊断的指标之一。 关键词下咽癌 免疫组化 原位杂交 增殖细胞核抗原 鳞状细胞癌 p16蛋白p53蛋白p27基因 ABSTRACT ObsttveTo the of and investigate expression PCNA,p27,p53 p16 in and mRNA cell ofthe protein carcinoma and gene squamous hypopharynx the betweenthem study and and relationship parameters clinicopathologic of the carcinoma prognosis andbetweenthe of hypopharyngeal expression and that PCNA,p27,p53,p16protein ofgene. MethodsParaffin—embedded tissuesectionsof48casesof of primary carcinomasandtreated from hypopharyngealsquamons diagnosed surgically to in1994 in2000aswellasin15CaSeSofconmaon January January mucosawere detected squamousepithelial for PCNA,p27,p53,p16protein and and in-situ gene expressionrespectivelybyimmunohistochemistry by hybridisation. ResultsTherate ofthe ofPCNAand was p53 overexpression protein inthe cancertissuethaninthecolmilon notablelyhigher hypopharyngeal thelossofthe of and tissue,but squamousepithelial expressionp27 p16 WaS related protein to significantly hypopharyngealcarcinoma{Po.05). Neitherthe of or to expression relatedthe PCNA,p27,p53p16protein siteof primary hypopharyngealcarcinoma.p27 proteinimmunoreactivity correlated witllclinical correlation negatively coefficient, stage(Spearman’S node P20.006),cervical lymphmetastasis,andpoor prognosis,butpositively with correlation histologicaldifferentiation(Spearman’S coefficient,P=O.008). There wasa correlation negative betweenthe of andclinical expressionp16 correlation lossof stage(Spearman’S coefficient,P=O.009).Thep16protein wasrelatedtoa shortenedsurvical expression period.p53 protein correlated overexpression withclinical node positively stage,cervical lymph and of metastasis,recurrencepoor PCNAWas prognosis.The overexpression related toanadvancedclinical histologicaldifferentiation, stage,poor recurrenceand nottometastasis poor ofcervicalnodes. prognosis,but lymph The of correlatedthatof expressionp53protein with PCNA.but positively -4. wimthatof and was expression p53gene negatively p27protein.p16 in cancertissuethan the inthe that common notablelyhigherhypopharyngeal toPCNA resultWaSreverse.There tissue,but epithelial gene,the squamous of PCNAmRNA acoincidencebetweenthe or and was expressionp27,p16 of lossofthe WaS that p16 protein.The expressiongene respective an clinicaland ofthe relatedto advancedstage prognosis significantly poor was with cancer.Therenonotetablecorrelation patientshypophaD,ngeal eitheror and between parameters. p27p53geneexpressionclinicopathologic ConclusionsThe of and may PCNA,p27,p16p53protein expression areferencein level, evaluating speed,malignancy provide proliferating and behavorof carcinoma of hypopharyngeal prognsis clinicopathological was the of almost patients.TheexpressionPCNA,p27,andp16protein mRNA.In was indenticalwimthatof cancel.it respective hypoplmryngeal unusualthat Occur altered,which p27gene may duringpost·transcription.In amakerfor for addition,PCNA diagnosis may early-period expressionprovide carcinoma. hypopharyngeal words cellnuclear Key hypopharyngealcarcinoma;proliferating antigen;immunohismchemistry;in-situhybridization;p27gene;p53 cellcarcinoma protein;squaraous protein;p16 .5. 刖 吾 下咽癌发病率较低,国内统计占全身恶性肿瘤的0.15%~o.24%,占 头颈部恶性肿瘤的2%。一般认为,下咽癌与喉癌发病因素相同,包括烟 酒刺激、病毒感染、电离辐射、遗传、营养失调及机体免疫功能下降等, 二者原发部位毗邻,治疗方法也相似,主要以手术或手术+放疗、化疗 等综合治疗,但预后相差很大,综合治疗后下咽癌5年生存率为26%一 47%,而喉癌为70%~90%以上【l】。近年来,随着分子生物学的飞速发展, 人们逐渐认识到细胞的癌变是一个多因素、多阶段的过程,在癌变的不同 阶段,都有不同的基因发生改变,因而要阐明下咽癌的发生、发展及预后因 素,必须在基因水平上进行研究。肿瘤相关基因总的分为两大类,即癌 基因与抑癌基因。目前研究最多的抑癌基因是与细胞周期密切相关的三 基因)。 细胞生命活动以细胞周期为中心,肿瘤发生、发展及治疗的研究, 都涉及到细胞周期及其调控。其中G1期检查点(Gl checkpoint)是细胞 周期调控的关键,而这个过程是通过细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase dependent fretinoblastorna gene)磷酸化,细胞进入s期;而CDKI则抑制CDK活性, 阻断Rb磷酸化,使细胞停滞于GI期,进而发生分化、凋亡或进入静止 期131。目前发现的CDKI按结构与功能不同分成两大类:一类是p16基 因家族编码的蛋白,即p15、p16、p18和p19蛋白,特异性抑制cyclin D.CDK4/CDK6的磷酸化激酶活性;另一类是p21基因家族编码的蛋白, 物,发挥其抑制活性。其中p16与p27是具有代表性的CDKIs。 D27基因于1994年被克隆。入p27基因定位于染色体 12p12.O-12p13.1交界处,包含2个参与编码的外显子,编码一个27kD 的蛋白质即p27蛋白,它由198个氨基酸组成,另有1个无编码功能的 A-CDK2等复合物特异性结合,抑制 E-CDK2及cyclin D-CDK6、ayclin 其活性,使细胞阻滞于G;期”1。据报道p27基因在肿瘤中突变率很低【5’‘71。 但也有报道肿瘤中存在p27基因甲基化,并认为与p27蛋白表达沉寂有 判引。大量的研究表明,p27与肿瘤的发生、进展密切相关,并可作为独 立的预后因子【9。1“。不过,有关下咽癌中p27基因表达研究的文献很少报 达为32%,p27蛋白表达下降与肿瘤预后差明显相关。国内目前未见报 道。 p16基因又名多肿瘤抑制基因(MTSl),于1993年被发现并被克隆。 人p16基因位于染色体9p21,全长8.5kb,由2个内含子和3个外显子 组成,2个内含子将3个外显子隔开,编码一个16kD的蛋白质即p16蛋 D的结合,直接抑制细胞周期关键酶 抑制其功能,阻断CDK与cyclin CDK4的活化,从而使细胞周期阻滞于G0/G1期【”】。p16基因改变形式主 要有:纯合性缺失、杂和性缺失、5’CpG岛甲基化及点突变等。据报道, 75%的恶性肿瘤有p16基因改变,超过了p53基因50%的突变率,其中 50%是纯合性和杂和性缺失,25%为点突变[14】。有关p16基因表达与肿 瘤发生、发展、预后相关性的报道很多,但结果不一。而在下咽癌中的 报道很少。郑美桦等【15】用免疫组化技术对喉癌、下咽癌手术标本进行研 究,发现p16蛋白表达强度与肿瘤组织分化有关,与肿瘤部位、临床分 期及患者病程无关,但他们是把两种肿瘤作为一个整体,而未能分别进 行研究。 p53基因是最早被发现的抑癌基因,也是目前研究最为广泛深入的基 1个外显子和10个内含 因之一。人p53基因定位于染色体17p13.1,由1 子组成,编码一个53kD的蛋白质即p53蛋白,它由393个氨基酸组成。 p53有野生型和突变型两种,由于野生型p53蛋白半衰期较短,而且在 免疫组化过程中易被除垢剂等破坏,因此免疫组化染色中检测到的实际 为突变型p53蛋白。野生型p53蛋白抗肿瘤活性主要是阻滞细胞周期于 Gl/Go期,使细胞不能进入s期,从而抑制肿瘤细胞增殖;野生型p53 基因可与DNA调控区结合,活化p21基因,中止DNA合成,使细胞生 .7。 长停止于G1关卡:野生型p53蛋白还可与TATA结合蛋白结合,抑制 Rb、PCNA及p53基因自身的转录,参与DNA的复制与修复【l”。肿瘤 中p53基因的改变形式主要是基因突变,其中,83%为错义点突变,6% 为无义点突变,10%为缺失和插Atl61。有关p53基因与肿瘤关系的研究 可见大量文献报道,但结果相差很大。而p53基因在下咽癌中表达报道 较少。有报道p53表达与下咽癌TNM分期、组织分化、转移及预后等 均无关[1”,而也有报道p53表达与患者预后显著相关【”1。国内于振坤、 刘克杰等[19-201均报道喉癌、下咽癌中p53蛋白异常表达与肿瘤临床分期、 病理分级及颈淋巴结转移相关,不过他们都是把两种肿瘤作为整体,实 际情况有待于进一步研究。 cell nuclear 增殖细胞核抗原(proliferatingantigen,PCNA)基因也与细 胞周期密切相关,已被认为是癌基因。人PCNA基因位于第20号染色体, 全长约7.0kb,由5个内含子和间隔的6个外显子组成,编码一个36kD 的蛋白质即PCNA,它由261个氨基酸组成。研究表明,PCNA基因很 少发生改变,但其表达受生长因子及p53蛋白等调控【16’211。PCNA表达 于细胞周期的G1后期,s期达到高峰,G2期下降,与DNA合成一致, 因而也是一种细胞周期调节因子,其合成水平反映了细胞增殖率及DNA 合成率,并与多种细胞周期条件因子密切相关,是目前肿瘤增殖活动研 究的可靠指标。PCNA主要分布于增殖细胞及受有丝分裂激活转化的淋 巴细胞,以及实体瘤中有增殖能力的细胞,而正常细胞含量很低。香港挂牌之全篇,一般 认为,PCNA表达增强与与肿瘤组织分化差、恶性程度高及预后差相关 【22’z41。目前有关PCNA在下咽癌中表达研究仍未见文献报道。 材料和方法 一标本 选取的48例下咽癌病例为南方医院1994年1月至2000年1月住院 手术治疗并有随访资料的患者,另15例为下咽部正常粘膜组织,所有标 本都得到本院病理科确诊。48例下咽癌中男43例,女5例,年龄32—72 岁,平均56.1岁,术后病理诊断均为鳞状细胞癌,其中高分化癌18例, 中分化癌14例,低分化癌16例。临床分期采用UICCl987标准,其中 I期6例,II期13例,III期15例,Ⅳ期14例。N。(术后病理诊断无颈 淋巴结转移)25例,N。(术后病理诊断为颈淋巴结转移)23例,术前 未行放疗或化疗,术后常规化疗与颈部放疗。l临床随访全部已满2年, 31例复发,随访满3年者为38例(未满3年而死亡病例包括在内),其中 18例存活。死亡原因包括肿瘤局部复发、颈淋巴结转移及远处转移等, 未发现死于其它疾病者。 二材料 (一)仪器与设备 Leica切片机Olympus双目显微镜及照相机微波炉冰箱恒温 水育箱高温烤箱普通烤箱湿盒分析天平移液枪 (二)试剂: 免疫组化染色试剂盒(SABCrio 鼠抗人p27蛋白单克隆抗体(1:100) 鼠抗人p53蛋白单克隆抗体(1:400) 鼠抗人PCNA单克隆抗体(1:100) 鼠抗人p16蛋白单克隆抗体(1:40) 以上抗体均为生物素标记 p16原位杂交检测试剂盒(包含p16寡核苷酸探针) p53原位杂交检测试剂盒(包含p53寡核苷酸探针) p27寡核苷酸探针 PCNA寡核苷酸探针 以上探针均为地高辛标志 以上试剂均购于武汉博士德公司 无水酒精、二甲苯、盐酸、30%双氧水、伊红购于学校试剂中心. DAB显色剂、3%柠檬酸缓冲液、20%甘油、甲醇、苏木素、硅化液、 封片剂等由学校肿瘤研究所实验室提供。 (三)常用试剂配制 l O.2M磷酸盐缓冲液口B)储备液:A液:Na2HP04 26.89加蒸馏水 至500ml B液:NaH2P04 13.89加蒸馏水至500ml。 2 O.01M PBS应用液:A液81ml+B液19ml+NaCl 179,加蒸馏水 至2000ml。 3 O.5M PBS:Na2HP04.12『}f2069+NaH2P04.2H200.49+NaCl 309, 加蒸馏水至1000ml。 4 0.5M枸橼酸盐缓冲液储备液:枸橼酸三钠(c6H5Na07.2H:0)759 +枸橼酸(c6H807.H。0)109,加蒸馏水至500ml。 5工作液(0.011d枸橼酸盐缓冲液):0.5M储备液20ml,加蒸馏水至 1000ml。 6 0.05MTBS:Tris.Cl 60.59+NaC 4.59,加蒸馏水至1000ml。 7 0.05M TBS液中,充分 DAB显色剂:将50mgDAB溶解于100ml 搅拌。溶解,用双层滤纸过虑,lml分装,于一4℃冰箱中保存。 三实验方法、步骤 f一)免疫组化 l操作前准备 (1)载玻片硅化处理: (2)4帅连续切片,切片置于70℃烤箱3小时; (3)每个标本任选1张作HE染色,核实病理诊断; 2免疫组化染色(SABC法) (1)切片脱蜡至水:二甲苯I液、Ⅱ液各5分钟,梯度乙醇(100%、 .10. 95%、90%、80%、70%)各1分钟; (2)新鲜配制的3%过氧化氢甲醇10分钟以灭活内源酶,蒸馏水洗3 次: (3)微波修复抗原:将切片浸入O.01M枸橼酸盐缓冲液,微波加热(15 分钟,中高火),自然冷却,蒸馏水洗3次: (4)滴加血清封闭液,室温30分钟,甩去多余液体,不洗; 洗2分钟×3次: (6)加二抗,室温(约20。C)下l小时,0.01PBS洗2分钟×3次; (7)加SABC40分钟,O.01PBS洗5分钟×4次; (8)DAB显色,lO.20分钟左右,时间由肉眼及显微镜下观察掌握; (9)蒸馏水洗,苏木素染色5.10分钟,梯度脱水、透明(每处各1 分钟),封片。 (二)原位杂交 1操作前处理 (1)载玻片准备:载玻片盐酸浸泡4小时一95%酒精浸泡过夜一蒸馏 水冲洗3次--DEPC处理水浸泡过夜一200℃烤箱4小时一硅化 一60℃烤箱烤干一切片面涂多聚赖氨酸一风干备用。 (2)切片:所有切片机上标本接触区、刀片等用DEPC水处理,6um 厚连续切片,70。C烤箱2小时,保存备用。 2原位杂交操作 (1)石蜡切片经常规脱蜡至水,3%过氧化氢甲醇室温处理10分钟以 灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗涤2次; (2)暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸稀释的新鲜胃蛋白 酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37。C消化20-40 分钟,时间由切片消化程度控制,找到最佳时间,0.5MPBS洗3 次×5分钟,蒸馏水洗1次; (3)预杂交:湿盒的准备一干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持 湿度,按每张切片20ul加杂交液,恒温箱404C杂交4小时,吸 取多余液体,不洗; (4)杂交一按每张切片20ul滴加杂交液,将原位杂交专用盖玻片的 保护膜揭开后,盖在切片上,恒温箱40。C过夜(约20--24小时); 阴性对照用缓冲液PBS代替探针; (5)杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37。C左右水温的2xSSC洗涤5分钟 ×2次,O.5xSSC洗涤15分钟×1次,0.2xSSC洗涤15分钟×1次: (6)滴加封闭液:37℃条件下30分钟,甩去多余液体,不洗; (7)滴加生物素化鼠抗地高辛:室温(约20。C)条件下2小时左右,O.5M PBS洗5分钟×4次,勿用其它缓冲液和蒸馏水; (8)滴加SABC:室温下30分钟,0.5MPBS洗5分钟×3次,勿用其 它缓冲液和蒸馏水; MPBS洗5 (9)滴加生物素化过氧化物酶,室温下30分钟左右,O.5 分钟×4次; (10)DAB显色,一般显色20一30分钟,充分洗涤; (i1)必要时苏木素复染,充分洗涤; (12)脱水,透明,封片。 四结果判定 p16、p53、p27蛋白:在高倍显微镜(250x)至少4个不同视野中 随机选取1000个细胞,计算表达阳性率,规定无阳性细胞为(一),阳 PCNA蛋白:在高倍显微镜(200x)下选择10个视野随机计算1000个细胞 index,PI) 中PCNA阳性细胞数,换成百分数,即为增殖指数(proliferating mRNA以胞核 Index,LI);p27、p53、p16 或称PCNA标记指数(Labelling 或(和)胞浆中出现黄色或棕黄色物质为阳性(+),否则为阴性(一)。PCNA 以胞核和胞浆阳性颗粒210%为阳性(+),否则为阴性(一)。 五统计学处理 采用SPSSl0.0统计软件,计量资料用T-test或one wayANOVA,计 Test或多变量的Knlskal-Wallis 数资料用非参数双变量的Mann-Whitney Test。 Test及kappa 结 果 分布特点 免疫组化阳性染色呈棕黄色或红褐色颗粒。p16和p27蛋白表达主 要位于细胞核,正常组织表达较强(见附图l、7),癌组织表达较弱(见附 图2、3、8、9),细胞浆办可见少量表达(见附图9)。p53蛋白阳性产物 位于细胞核,癌巢周围结缔组织及正常组织均为阴性(见附图14、15、 16)。PCNA分布于核内,高分化癌PCNA在癌巢周边分布较多,癌巢中 央阳性细胞少(见附图21、22);中分化癌阳性细胞多呈巢状或片状分布(见 附图23);低分化癌PCNA阳性细胞呈弥漫性分布(见附图24);正常粘膜 mRNA原位杂交阳性显色呈棕黄色或黄色,主要定位于细胞核和细胞浆 有的主要在胞浆r见附图18、19、26、27)。下咽癌颈部转移淋巴结中癌 细胞及部分淋巴细胞PCNA及其mRNA表达均呈阳性(见附图29、30)。 二结果分析 (一)正常组织与癌组织中表达比较及免疫组化与原位杂交相关性分析 1 下咽癌与正常组织PCNA及其基因mRNA表达比较(见表l、2) 表1 PCNA蛋自及其基因mRNA表达比较 -13. 组织PCNA增殖指数显著高于正常组织(P0.001)。下咽癌组织PCNA mRNA均阳性表达,正常粘膜组织有9例表达,但强度较弱。癌组织PCNA 基因mRNA阳性表达显著高于正常组织(PO.001)。 表2 PCNA蛋白与mRNA表达相关性分析 注:McNemarTest,P=0.250,kappa指数为O.644 PCNA蛋白表达阴性的3例标本mRNA检测亦呈阴性,原位杂交呈 阳性的57例标本,其免疫组化检测结果也均为阳性,两种方法检测结果 一致性为95.2%(60/63x100%),检验结果显示二者无显著差异fP=0.250), kappa指数为O.644,故认为下咽癌及下咽正常粘膜组织PCNA与其 mRNA的表达基本一致。 2下咽癌与正常组织p27蛋白及其基因mRNA表达比较(见表3、4) 表3 p27蛋白及其基冈mRNA表达比较 正常组织p27蛋白表达明显高于下咽癌组织俾=0.013)。癌组织中 p27基因mRNA表达率较其蛋白表达率高,但无显著差异饵=0.498):癌 组织p27基因mRNA表达亦与正常组织中的表达无显著差异(P0.129)。 表4 p27蛋白与mRNA表达相关性分析 TestP=0.453 注:Kappa指数为0.687,McNerrmr p27蛋白及其mRNA检测同为阳性或阴性的分别有45例与11例,7 例结果不符,包括5例原位杂交结果阳性而免疫组化结果阴性,2例免 疫组化呈阳性而原位杂交呈阴性,两种方法检测结果一致性为 0.687,故认为下咽癌与下咽部正常粘膜组织p27蛋白与mRNA的表达基 本一致。 3下咽癌与正常组织p53蛋白及其基因mRNA表达比较(见表5、6) 表5 p53蛋白及其基因mRNA表达比较 正常组织不表达突变的p53蛋白,癌组织p53蛋白表达显著高于正 常组织(P0.001)。而正常组织p53基因mRaNA阳性表达率显著高于癌组 表6 p53蛋白与mRNA表达相关性分析 注:Kappa指数为~O.427 p53蛋白及其mRNA检测同为阳性或阴性的分别只有lO例与8例, 45例检测结果不相符,两种方法检测结果一致性仅为8.6%(18/63×100%)。 kappa指数为一O.427,可以认为原位杂交与免疫组化两种方法检测结果 基本不相符。 4下咽癌与正常组织p16蛋白及其基因mRNA表达比较(见表7、8). 表7 p16蛋白及其基因mRNA表达比较 正常组织p16蛋白表达明显高于下咽癌组织伊=0.046),同组中p16 蛋白表达阳性率较其mRNA表达阳性率高,但无显著差异(P=O,682); 而下咽癌组织p16基因mRNA阳性表达率显著低于正常组织(p=O.030)。 表8 p16蛋白与mRNA表达的相关性分析 TestP=0.727 注:kappa指数为O.726,McNernar p16蛋白及其mRNA检测同为阳性或阴性的分别有36例与19例, 其中13例正常组织两种检测结果完全一致。两种方法检测结果一致性为 数为0.726,说明下咽癌与下咽正常粘膜组织p16蛋白与mRNA的表达 基本一致。 (二)p27、p53、p16蛋白及其基因mRNA表达与下咽癌临床生物学行 为及预后的相关性分析 梨状窝区、后壁区、环后区癌PCNA、p27、p53、p16蛋白及其基因 mRNA表达均无显著差异伊值均大于0.05)。 1 p27蛋白及其mRNA表达与下咽癌(见表9、10) 如表9所示,p27蛋白表达与下咽癌临床分期、组织分化程度有关(P 分别为O.037与O.024),相关分析显示,p27蛋白表达与肿瘤临床分期(由 低到高))负相关(Spearman’sRj—O,393,P=0.006),与肿瘤组织分化程度 mRNA表达与 (由低到高)呈正相关(Spearman’sR=0.381,P=0.008);而p27 肿瘤临床分期、组织分化程度无关fPO.05)。 如表10所示,下咽癌伴有淋巴结转移组p27蛋白表达显著低于无淋 巴结转移组(P=o.019),术后存活期大于3年组p27蛋白表达显著高于存 mRNA表达与下咽癌有无淋巴结转移、 活期小于3年组(P=O.033),而p27 是否复发及预后均无关fP值分别为O.137、O.389、O.341)。 表9 p27蛋白、mRNA表达与下咽癌临床病理参数相关性分析 R=~O.393,P--0.006; 注:Bivariatc相关分析,*Spearman’s R卸.381.P=0.008 ●Spearman’s 表10p27蛋白、mRNA表达与-F咽癌转移、复发及预后分析 -18- 2 p53蛋白及其mRNA表达与下咽癌(见表11、12) 表11p53蛋白、mRNA表达与F咽癌临床病理参数相关性分析 例p53蛋白表达p53mRNA表达 项目 P值 P值 I ll 2 2 2 5 0.558 6 5 0.754 临床 II 8 2 3 1 2 分期 4 4 III 17 3 3 4 7 7 M Ⅳ 12 3 4 2 3 4 8 组织 高183 3 5 7 0.302 9 9 O.125 由 14 2 4 2 6 6 8 分化 低 16 5 5 2 4 6 12 p53蛋白、mRNA表达均与下咽癌临床分期、组织分化程度无显著 相关(P0.05)。 表12p53蛋白、mRNA表达与F咽癌转移、复发及预斤分析 例p53蛋白表达p53mRNA表达 项目 P值 P值 数 + + 15 O.158 淋巴结 有 23 19 4 O.013 12 转移 无 25 12 13 术后 是 31 24 7 O.013 13 18 0.735 复发 否 17 7 10 8 9 存活期 ≥3 18 7 11 0.004 9 9 0.214 (年) 3 20 17 3 6 14 ..19.. 下咽癌伴有颈淋巴结转移组、术后复发组、患者术后存活期低于3 年组p53蛋白表达显著高于无淋巴结转移组(P=0.013)、无复发组 mRNA表达与下咽癌有 (P=0.013)、存活期大于3年组(Po.004);而p53 无淋巴结转移、是否复发及患者预后均无关(P值分别为O.158、O.735、 0.214)。 3 p16蛋白及其mRNA表达与下咽癌(见表13、14) 表13p16蛋白、mRNA表达与下咽癌临床病理参数相关性分析 R=一O.374,P=0.009;·为II与Ⅳ 注:}Bivariate相关分析,Spearman’S ●为ⅡI与I;◆为I与Ⅳ。 R= p16蛋白表达与下咽癌临床分期(由低到高)呈负相关(Spearnum’s --0.374,P=0.009);p16 mRNA表达亦与下咽癌临床分期相关但=o.029), Ⅳ期肿瘤1916 其它各期间比较无显著差异(PO.05);1316蛋白及mRNA表达均与下咽癌 组织分化无显著相关(P值分别为O.201与0.125)。 表14p16蛋白、raRNA表达与F咽癌转移、复发及预后分析 例p16蛋白表达p16mRNA表达 项目 P值 P值 数 + 一 + 一 10 13 0.158 淋巴结 有 ” ¨ 眩 O.16l 16 9 转移 无 笛 8 术后 是 孔 =宝 ¨ 0.207 15 16 0.283 复发 否 他 5 1l 6 幅 H 4 0.020 14 4 0.009 存活期 (年) 3 20 8 12 7 13 p16蛋白和mRNA表达与下咽癌预后有关,存活期大于3年组p16 蛋白及其mRNA表达均显著高于存活期低于3年组口值分别为0.020与 0.009),而与有无淋巴结转移、术后是否复发均无显著相关(PO.05)。 4 PCNA及其mRNA表达与下咽癌(见图1一图3) 图1 PCNA表达与下咽癌临床分期及组织分化程度分析 _21. 10。84(%),高中分化组增殖指数显著低于低分化组(P=O.034);I—II期组 数显著高于I—II期组(P=0.021)。 圈2有、无淋巴结转移纽PCNA平均增殖指数 下咽痉中PCNA表达在淋巴结转移组与无淋巴结转移组中无显著 差异fP=O.102)。 匿3 PCNA表达与下嘲癌复发及预后分析 -22. 12.16(%),复发组增殖指数显著高于未复发组(P=O.033);术后存活期大 于3年组PI=67.oo+1 大于3年组增殖指数显著低于3年以下组fP=0.003)。 1 p27蛋白与p53蛋白 表15 卜咽癌中p27与p53蛋白表达的相关性分析 表15显示,下咽癌中p27蛋白与p53蛋白表达呈明显负相关 (Spearman’R=一0.295,P=0.042)。 2 p27蛋白与p16蛋白 表16下咽癌中p27与p16蛋白表达相关性分析 表16显示,下咽癌中p27蛋白与p16蛋白表达程度呈正相关趋势 但无统计学意义(Spearman’S R=0.242,P=0.097)。 3 p53蛋白与p16蛋白 表17下咽癌中p53与pt6蛋白表达相关性分析 p16表达 p53蛋白表达 +++ 1 2 1 6 ++ 2 4 3 3 + 3 l 2 3 —— 2 5 2 8 表17显示,下咽癌中p53蛋白与p16蛋白表达无明显相关 R=一O.031,P。0.83钔。 (Spearman’s 4 PCNA与p27、p53、916蛋白 表18 卜.咽癌中PCNA与p27、p16及p53蛋白表达相关性分析(ji±s) 蛋白表达 例数 PI(%)P值 + 33 68.644-11.1l 0.007 p27 —_ 15 77.73±8.57 + 28 69.25±11.09 O.10l p16 —_ 20 74.60±10.70 + 3l 74.39±9.40 O.013 p53 — 17 66.18±12.35 表18显示,p27蛋白表达阳性组PCNA增殖指数显著低于p27蛋白 表达阴性组(P=O.007),p16蛋白阳性组PCNA增殖指数也低于p16阴性 组,但差异无统计学意义(P=o.101),而p53蛋白阳性表达组PCNA增殖 指数明显高于p53蛋白阴性表达组(P=O.013)a .24.. 讨 论 一p16与下咽癌 p16基因是多肿瘤抑制基因,在人类多种恶性肿瘤中都存在p16基因 的改变,频率达25%一85%[25】。本实验显示,下咽癌中p16基因失表达 率为45.8%,而p16蛋白失表达率为41.7%,癌组织p16蛋白及其mRNA 阳性表达率显著低于正常组织,提示p16基因失表达可能参与了下咽癌 生物学过程。 Reed等【26】报道p16基因失活在肿瘤发病中属晚期事件。他们认为p16 基因失活在肿瘤发病早期并非必需,丽与肿瘤的浸润和转移有关。本实 验显示p16基因及其蛋白失表达与下咽癌临床分期J下相关,临床Ⅳ期肿 瘤p16基因mRNA失表达率显著高于临床I、II期肿瘤,但其它各期间 差异均不显著,表明p16基因失活与下咽癌临床晚期密切相关。实验中 未发现p16表达与下咽癌淋巴结转移、肿瘤原发部位、组织分化、术后 是否复发等相关。 实验结果表明p16失表达与下咽癌患者预后差相关,存活期大于3 年组患者p16基因及蛋白表达明显高于存活期小于3年患者。这可能由 于p16失表达,CDK4活性增加,导致细胞生长加快,加速了肿瘤的恶 性演变进程。 从实验结果看出,免疫组化检测p16蛋白表达与原位杂交检测p16 的表达显著相关,这与郑建明等【271在乳腺癌研究报道相符。由于原位杂 交操作较复杂,耗时长,且对材料要求较高,所以在临床工作中,可以 考虑通过检测组织p16蛋自来反映其基因表达水平。 mRNA阳 此外,实验中发现在48例肿瘤组织中,仅3例表现为p16 性与蛋白阴性,提示下咽癌中无义突变或移码突变可能较为少见。 二p27与下咽癌 p27基因目前亦被列为抑癌基因,不过,与其它抑癌基因如p53、p16 基因等不同,p27基因水平极少发生改变,且p27对细胞的调节主要在 转录后【28‘2引。本实验结果显示下咽癌组中p27基因表达率高于其蛋白的 表达率,虽然差异无显著意义,但由于癌组织p27蛋白表达显著低于正 常组织,而两组问p27基因表达差异不显著,而且有5例癌组织中检测 mRNA而p27蛋白表达阴性,4例p27基因强表达而其蛋白表达较 到p27 弱,证实了p27基因水平上改变少而其变化主要发生在转录后蛋白质的 翻译或修饰阶段。因而要研究p27与肿瘤的相关性,应以p27蛋白表达 研究为主。 本实验下咽癌组织p27蛋白阳性表达率为68.8%,显著低于下咽正 常粘膜组织中的阳性表达率(93.3%),提示p27蛋白表达缺失可能与下 咽癌发生有关,并可能成为下咽癌早期诊断的一个新指标。本实验结果 显示,p27蛋白表达与下咽癌的f临床分期负相关,与组织分化程度(又低 到高)J下相关;p27蛋白表达下降还与下咽癌颈淋巴结转移有关,这可能 是因为p27蛋白缺乏可导致细胞间粘附力下降,使肿瘤更容易发生转移 1301。以上结果提示p27蛋白失表达程度可能反映了下明癌进展速度、恶 性程度及侵袭性。不过Esposito等[431在研究中发现p27蛋白表达水平与 肿瘤组织分化、淋巴结转移、临床分期及癌周围浸润均无关,与预后有 关。而Choi等㈣报道p27蛋白表达与头颈粘液表皮样癌的临床分期、组 织分化、淋巴结转移及预后均相关。本研究也显示,p27蛋白失表达的 下咽癌患者术后3年生存率也较p27蛋白阳性组低,表明p27蛋白表达 与下咽癌预后有关,并可能作为判断下咽癌预后的一个独立指标。 有报道p27蛋白异常定位(胞浆表达)与患者预后差相关,表明p27 蛋白胞核定位对其细胞周期阻滞功能是必须的【331。可能是因为细胞核内 E-CDK,cyclin A—CDK 的p27蛋白才能或更容易与cyclin D-CDK及cyclin 等复合物结合,抑制细胞增殖。在本实验研究中,亦出现p27蛋白在胞 核与胞浆共表达现象,但只在极少数细胞中发生,而且在肿瘤组织与正 常组织均出现,不具有统计学意义,因而认为p27蛋白异位表达在下咽 癌中是偶发事件,与肿瘤的生物学行为无关。 本实验结果表明,p27基因mRNA的表达与下咽癌临床、病理参数及 患者预后均无显著相关,这与文彬等[341报道的结果完全一致。表面看来 p27蛋自与mRNA表达相互矛盾,但进一步分析发现,本实验免疫组化检 测的p27蛋白表达水平与原位杂交检测的基因表达水平吻合度相当高 -26. 0.687,因而认为下咽癌和下咽部正常组织p27蛋白与其mRNA的表达基 本一致。但由于基因水平表达改变较少,故表现为基因失表达的癌组织 中一般伴有蛋白表达缺失,而蛋白失表达的癌组织并不意味基因改变。 所以,虽然p27蛋白表达下降与下咽癌进展的临床分期、较差的组织分 化、颈淋巴结转移及预后差等临床参数显著相关,但这种相关性并未体 现在基因表达水平上。 三p53与下咽癌 由于野生型p53蛋白半衰期较短,大约6分钟一20分钟,因此即使 在分裂期的乖常细胞,检测到的p53蛋白水平也是很低的。而突变型p53 蛋白半衰期达20小时--40小时,因此免疫组化染色中检测到的实际为 突变型p53蛋白,并可作为肿瘤诊断的一个指标【351。野生型p53分子主 要作用是抑制细胞增殖、检测DNA损伤并加以修复或引发细胞程序化死 亡;而突变型p53蛋白则加速细胞转化,并由于细胞DNA损坏得不到修 复,致使遗传不稳定性及突变加剧,因此突变的p53蛋白不但无抑癌作 用,相反有促癌作用(360”。 Caminero等【38】报道p53蛋白表达与口咽癌临床分期、组织分化及淋 巴结转移均无关,而与肿瘤复发及患者预后相关。本实验显示,p53蛋 白表达与下咽癌原发部位、临床分期、组织分化等无关,而p53蛋白过 表达与肿瘤淋巴结转移、术后复发及患者预后不良相关。因而认为p53 基因突变可能发生于下咽癌中晚期,并推测由于突变的p53蛋白失去了 对细胞生长抑制及DNA损伤修复功能,细胞继续分裂,使DNA损伤扩大, 肿瘤就更易发生复发与转移,由此也影响患者预后。Rowley等【181也报道 了下咽癌中p53表达增强与患者预后差显著相关。因此,p53蛋白可能 成为下咽癌患者预后判断的一个可靠指标。 有研究指出,p53基因突变并不意味着其免疫组化结果阳性,因为有 些基因突变不能导致蛋白过表达而被检测到【39】。因而理论上推断肿瘤组 织中p53 mRNA表达要强于p53蛋白的表达。而本实验结果刚好相反,且 正常组织中mRNA显著高于癌组织以及p53蛋白与mRNA检测结果基本不 相符(kappa指数为一O.427),其主要原因是本实验使用的是野生型mRNA mRNA 探针,实验中检测到的可能主要是野生型mRNA。实验结果未发现p53 表达与下咽癌的临床、病理等参数间有明显相关。秦历杰m】用野生型p53 mRNA mRNA探针通过原位杂交方法检测了胃癌及其癌前病变组织中p53 的表达,结果显示,癌前病变组织p53mRNA的表达显著高于胃癌组织, 而且胃癌中p53mRNA表达与肿瘤临床分期、组织分化、转移及预后等均 无关,这与本实验结果完全一致。 mRNA探针原位检测非小细胞型肺癌细胞 而Ebina等…】用突变型p53 中mRNA,同时检测p53蛋白表达,结果在每一份标本中都发现突变型mRNA 的分布与免疫组化检测到的p53蛋白分布一致。用野生型p53mRNA探针 原则上应和野生型mRNA杂交而出现杂交信号,但在一定程度上,它能否 和突变型mRNA结合,目前还不清楚。因此认为,要深入研究下咽癌中 p53基因的改变,必须结合单链构像多态性分析、DNA序列测定等其它分 子生物学方法。 四PCNA与下咽癌 研究发现,PCNAmRNA在G0期很低,G.一S期积累,进入S期迅速下 降,s晚期和G:枷期又升高,与细胞周期活动一致,因而PCNAmRNA表 达水平能反应细胞增殖活性【42】。因此,PCNA是判断正常细胞与肿瘤细胞 周期,检测细胞增殖指数的重要标志物【431,而细胞过度增殖可能导致肿 瘤的发生,因而肿瘤组织细胞增殖水平可能反映了人类肿瘤的恶性程度。 一般认为,肿瘤分化越低,细胞增殖力越强,恶性程度越高。本研 究表明,低分化组PCNA表达显著高于高分化组,提示PCNA可能作为 肿瘤恶性程度的标记分子。凌玲等Ⅲ】在对喉癌病人的研究发现,PCNA 表达高低与喉癌的临床分期一致,111.Ⅳ期喉癌PCNA表达明显高于I. II期,而与有无颈淋巴结转移无关,这与本实验结果一致。这可能是因 为PCNA只表明肿瘤的增殖程度,与肿瘤早、中期活动密切相关,而与 肿瘤的晚期行为关系不大;实验结果还显示PCNA在下咽癌中的表达明 显高于下咽正常粘膜组织,表明PCNA可能作为下咽癌早期诊断的一个 标记物。由于PCNA表达强度可以反映细胞增殖活性,因而还可能用于 判断肿瘤细胞的生长速度,协助鉴别良恶性病变。 .28. 肿瘤的复发、预后与肿瘤的恶性程度密切相关。本实验结果表明, 下咽癌中PCNA表达增强与肿瘤复发及预后差相关,这可能是由于肿瘤 细胞增殖能力越强,术后残留癌细胞在局部生长越快,越易复发:也预 示患者预后不良。在其它恶性肿瘤研究中也报道了类似结果【45】,表明 PCNA的表达可作为判断下咽癌预后的一个指标。本实验还发现,在癌 巢周边及肿瘤浸润的边缘区域,PCNA表达较高;而在癌巢中央区,尤 其有明显角化的癌细胞,PCNA表达极低,甚至不表达(见附图21、22), 在其它肿瘤中也有类似的情况【46】,因而这种现象的产生是由PCNA自身 的特性所决定的,但具体机制还有待于进一步研究。 本实验显示,下咽癌、正常组织PCNA与其mRNA的表达基本一致 (kappa指数为O.644)。从杂交信号看,正常组织较癌组织明显减弱,阳 性表达率也显著低于癌组织,表明PCNA基因表达增强参与了下咽癌的 发生过程。目前国内外文献很少见对肿瘤中PCNAmRNA进行检测的报 道,而只检测其蛋白表达,原因可能为肿瘤中PCNA蛋白表达基本反映 了其基因的表达水平;作为一种癌基因,人们更关心的是促使其表达升 高的机制,以便找到对抗其表达升高的方法,而并非升高本身;而且, 在更多情况下,人们只想了解肿瘤细胞的增殖程度,从PCNA蛋白表达 水平即能得到充分体现,此外,PCNA基因很少发生改变【211,故原位杂 交检测PCNA mRNA的意义不大。 五下咽癌中PCNA、p27、p53及p16蛋白表达的相关性 p16与p27蛋白同属CDKI,在细胞周期中功能相似,因而推测二者 在抑制肿瘤的过程中有一定协同作用。本实验相关分析显示,p16与p27 R=0.242),但统计学意义不显著 蛋白存在一定相关趋势(spearman’s (P=O.097),实际情况可能需要通过大量样本及结合分子动力学实验研究 证实。 实验显示,下咽癌中p27蛋白表达与p53蛋白表达显著负相关 (Spearman’5 合,p53蛋白即可起到转录因子作用,活化CDKI基因,出现p27蛋白表 达增加【l“。因而推测由于突变的p53失去了这种功能,故可导致p27表 达下降。953蛋白阳性表达的下咽癌组织中p16蛋白表达也有所下降, 但二者之间并无显著相关性,因而不能从突变型p53基因表达简单推断 p16基因表达改变情况。 实验中也显示,下咽癌中PCNA表达与p27蛋白表达显著负相关 (P=O.009),与朱友群等报道的结果一致f471。PCNA与p16蛋白表达也存 在负相关趋势(P=0.101)。而PCNA与p53蛋自表达呈显著正相关 (P=0.013),这表明处于分裂增殖状态的肿瘤细胞由于p27、p16蛋白等 CDKI的表达下降或突变型p53蛋白过表达,失去了对细胞增殖的反馈性 抑制,PcNA表达增强,从而表现为无限增殖倾向,促进了肿瘤的恶性发 展。 六存在问题 mRNA前体在细胞核内合成,经过进一步加工形成完整的mRNA 后转运到细胞浆进行蛋白质合成。故一般mRNA原位杂交阳性信号胞 浆多于胞核。而本实验显示阳性杂交信号在胞核中出现较多,少部分甚 至仅出现在胞核r见附图11、17),而且有少数蛋白表达呈阳性者而未见 阳性杂交信号。这可能是因为组织石蜡切片胞浆内的RNA较胞核内的 RNA更容易降解。究其原因考虑为以下几方面:组织标本固定不良或 固定时间过长,有些夼覜準翋霜躓汜荎恅厙靡毞狟粗v139www.777748.com香港设协调机制支援34万家中小企业:银行业承诺不


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